АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ
В 1981 г. из внутренней мембраны МХ был выделен К+-селективный канал (митоКАТФ) [Миронова и др., 1981], который ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)]. В 1991 г. этот канал был впервые обнаружен во внутренней мембране МХ методом пэтч-кламп [Inoue et al., 1991], позднее появились аналогичные работы других исследователей [Nakae et al., 2003; Fikret et al., 2004; Dahlem et al., 2004; Bednarczyk et al., 2005]. В настоящее время канал активно изучается, поскольку обнаружено, что он участвует в адаптации организма к гипоксии [Garlid et al., 1997]. В настоящее время основными методами выделения АТФ-ингибируемого МХ калиевого канала (митоКАТФ) является метод водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; Миронова и др., 1996 (I)] и солюбилизация белка-канала из мембраны Тритоном Х-100 с последующей очисткой ионообменной хроматографией. При этом митоКАТФ канал выделяют в виде белка с молекулярной массой 55 кДа [Mironova et al., 2004].
1.3.1
Структурная организация митоКАТФ канала
Так как митоКАТФ имеет ряд общих свойств с цитоКАТФ и регулируется общими регуляторами, было предположено, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [Mironova et al., 1999] и состоит из канальной субъединицы [Mironova et al., 2004] и регуляторной [Bajgar et al., 2001]. Белок с м. м. 55 кДа, выделенный из внутренней мембраны МХ печени крысы, является, по-видимому, канальной субъединицей митоКАТФ. При встраивании в БЛМ этот белок формирует АТФ-зависимые каналы (митоKIR). Активность этих каналов не блокируется глибенкламидом и специфическим ингибитором митоКАТФ 5-ГД, и не активируется кромакалимом и ддиазоксидом. Однако эти препараты влияют на АТФ-зависимый калиевый транспорт в изолированных МХ, где есть обе субъединицы канала [Mironova et al., 2004].
МитоКАТФ, также как и клеточный, является, по всей вероятности, гетеромультимером, состоящим из калиевого канала, белка с молекулярной масой 55 кДа, который имеет выпрямляющие свойства и который, по аналогии с цитоплазматическим каналом, был назван митоKIR (от англ. Inward rectifying) [Mironova et al., 2004] и рецептора, чувствительного к сульфонилмочевинам и поэтому названного митоSUR (от англ. sulphonylurea) (Рис. 3) [Mironova et al., 1999; Bajgar et al., 2001].
Кi для АТФ на реконструированном в БЛМ митоKIR выше, чем в интактных МХ и Mg2+ для этого ингибирования не требуется. Тогда как для АТФ-ингибирования канала, локализованного в интактных МХ, присутствие магния было необходимо [Mironova et al., 2004]. Те же различия были обнаружены при сравнительном изучении влияния АТФ и сульфонилмочевин на цитоKIR и целый цитоКАТФ [Tucker et al., 1997]. Известно, что основной участок связывания АТФ в цитоКАТФ локализован на канальной субъединице. Регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [Tucker et al., 1997].
Рис.3. Рабочая модель структуры МХ АТФ-зависимого К+ канала [Mironova et al., 2004]
Приведенные выше результаты исследований митоКАТФ подтверждают предположение о том, что белок с м.м. 55 кДа является канальной субъединицей целого митоКАТФ. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с м.м. 63 кДа, связывающийся с меченым глибенкламидом [Bajgar et al., 2001].
В то же время, результаты исследований, проведенных на МХ сердца, с использованием антител на Kir6.1 и Kir6.2, а также на SUR1 и SUR2, показали, что в МХ кардиомиоцитов присутствуют Kir6.1 и Kir6.2, но нет ни SUR1, ни SUR2. Однако в них обнаруживается SUR2-подобный белок, который, возможно, является сплайсированным вариантом SUR2 [Lacza et al., 2003 (I)].
При исследовании митоКАТФ мозга, близкого по структуре к цитоКАТФ [Lacza et al., 2003 (II)], с использованием АТ к KIR6.1 и KIR6.2, а также SUR1 и SUR2 субъединицам цитоКАТФ было показано, что очищенные МХ мозга содержат преимущественно KIR6.1 и, в меньшей степени, KIR6.2 и не содержат SUR1 и SUR2. Согласно выводам авторов, в формировании митоКАТФ мозга участвует укороченный вариант SUR2 или белок, подобный по структуре SUR2. Кроме того, показано, что МХ мозга содержат в 8 раз больше KIR6.1 и SUR2-подобного белка, по сравнению с общим белком ткани мозга, что подтверждает локализацию этих белков в МХ [Lacza et al., 2003 (II)]. Тот факт, что м.м. митоKIR мозга несколько ниже (50 кДа), чем у митоKIR печени [Mironova et al., 1999; 2004], предполагает наличие тканевой специфичности в структуре каналов.