Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа.

Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка

Выделение и первичная очистка белка проводились методами, описанными в п.п. 2. Белок хранили при температуре -20°С. Фракции, содержавшие белок с м.м. 55 кДа и обладавшие АТФ-ингибируемой К+-селективной активностью, накапливали, затем диализовали против 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4) в течение ночи при постоянном перемешивании и температуре 4°С. Обессоленную фракцию концентрировали обратным диализом с использованием полиэтиленгликоля-20000 (ПЭГ) при 4°С. Сконцентрированную фракцию подвергали дополнительной очистке методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Для электрофореза использовали 10%-ый ПААГ в системе Дэвиса [Davies, 1964]. На геле наблюдалась только одна полоса - белковая зона, в которой определялась АТФ-зависимая К+-транспортирующая активность. Полосу исследуемого белка вырезали из геля, измельчали и элюировали в течение 12 часов при постоянной силе тока (8 мА) и температуре 4°С. Среда элюции содержала 10 мМ Трис-HCl, 38 мМ глицина, рН 8.3. Концентрацию белка в элюате определяли методом Лоури [Лоури, 1951]. Чистоту белка контролировали методом SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1970]. Выход белка составлял около 30-50 мкг из 100 г ткани печени.

К+-транспортирующие свойства выделенного белка и чувствительность к аденозин-5’-трифосфату оценивали при встраивании его в бислойную липидную мембрану.