Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала

Классический кальретикулин входит в состав семейства высококонсервативных белков с м.м. около 55 кДа, локализующихся как в саркоплазматическом, так и в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, скелетной и гладкой мускулатуры, сердечной мышцы [Fliegel et al., 1989]. Белки этого семейства связывают ионы кальция, цинка, других металлов, сахара, нуклеотидфосфаты, в частности, УДФ. Они также выступают в роли шаперонных белков в процессе фолдинга, участвуют в системе белковой машинерии, регуляции апоптоза, мейоза, экспорта белков из ядра клетки. Известны гомологи гена кальретикулина у мыши, крысы и человека. У крысы гомологичный ген кальретикулина локализован в 19 хромосоме. При этом ранее в нашей лаборатории было показано, что при окрашивании белков в геле после ДДС-ПААГ электрофореза по Шиффу, исследуемый белок с м.м. 55 кДа давал положительную реакцию, что говорит о способности его связывать сахара [неопубликованные данные]. Кроме того, определялось также и сродство белка-канала к кальцию с использованием 45Ca [неопубликованые данные]. Было показано, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа проявляет достаточно большое сродство к этому иону. Эти результаты согласуются с данными по взаимодействию кальретикулина с сахарами и кальцием.

Причем, необходимо заметить, что большая часть перекрывающейся последовательности приходится на Р-домен кальрегулина, способного связывать нуклеотиды. Также, в перекрывающуюся последовательность включены высоконсервативные остатки триптофана, характерные для кальрегулинов в данных сайтах первичной последовательности, и стерически идентично расположенные в первичной аминокислотной последовательности кальрегулина консервативные антипараллельные бета-листы, формирующие Р-домен.

Следует особенно отметить тот факт, что в составе прекурсорного белка и кальретикулинов различных типов имеется характерная гидрофобная сигнальная последовательность из 17 аминокислотных остатков, MLLSVPLLLGLLGLAAA (1-17), посттрансляционно удаляемая протеолитическим расщеплением [Murthy et al., 1990] (Рис.16). Эта последовательность отсутствует в изучаемом нами белке с м.м. 55 кДа. Интересно также то, что N-концевая последовательность с 17 по 27 аминокислотный остаток DPAIYFKE кальретикулина совпадает с последовательностью N-концевого участка 55 кДа белка, структура которого была определена ранее в нашей лаборатории реакцией химической деградации по Эдману [неопубликованные данные] (Рис.16).

Кроме того, С-конец прекурсорного белка, как и всех кальретикулинов, содержит сигнальную последовательность KDEL, определяющую локализацию этих белков в ретикулюме [Schweizer et al., 1993], в то время как у изучаемого 55 кДа белка такой последовательности нет (Рис.15, 16), что, вероятно, свидетельствует о том, что белок с м.м. 55 кДа локализуется не в ретикулюме.

1 MLLSVPLLLG LLGLAAADPA IYFKEQFLDG DAWTNRWVES KHKSDFGKFV

51 LSSGKFYGDQ EKDKGLQTSQ DARFYALSAR FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE

101 QNIDCGGGYV KLFPGGLDQK DMHGDSEYNI MFGPDICGPG TKKVHVIFNY

151 KGKNVLINKD IRCKDDEFTH LYTLIVRPDN TYEVKIDNSQ VESGSLEDDW

201 DFLPPKKIKD PDAAKPEDWD ERAKIDDPTD SKPEDWDKPE HIPDPDAKKP

251 EDWDEEMDGE WEPPVIQNPE YKGEWKPRQI DNPDYKGTWI HPEIDNPEYS

301 PDANIYAYDS FAVLGLDLWQ VKSGTIFDNF LITNDEAYAE EFGNETWGVT

351 KAAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEE EAEDKEDEDD RDEDEDEEDE

401 KEEDEEDATG QAKDEL

Рисунок 14. Последовательность прекурсорного белка. Сигнальная последовательность, характерная для кальретикулинов, выделена серым цветом, N-концевая последовательность, гомологичная таковой у исследуемого белка-канала с м.м. 55 кДа – жирным шрифтом, сигнальная последовательность KDEL, остутствующая в изучаемом белке – серым цветом и жирным шрифтом