Электронная микроскопия МитоКАТФ канала
Для более точного доказательства локализации белка с м.м. 57 кДа во внутренней мембране митохондрий было проведено электронно-микроскопическое исследование срезов тканей печени и сердца с использованием АТ на белок с м.м. 55 кДа. Идентификации эндогенного белка-канала и его связывание с АТ проводились с помощью вторичных антител, меченых коллоидным золотом (диаметр гранул – 10 нм). Как видно из рисунка 21, такого рода гранулы золота локализуются во внутренней мембране митохондрий как печени (Рис.21а), так и сердца (Рис.21б), причем в сердце их больше, что соответствуют данным о большей плотности митоКАТФ каналов в митохондриях сердца. Локализуются эти каналы ближе к месту контакта внутренней и внешней мембраны митохондрий, что особенно проявляется с митохондриях сердца (Рис.21б).
Рис.21а. Электронная микроскопия среза гепатоцита крысы. а - Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку. Черные гранулы (указаны стрелкой) -сайты локализации К+-транспортирующего белка с м.м. ~ 55 кДа в митохондриях.
Рис.21 б. Митохондрии и саркоплазматический ретикулум (СР) на срезе кардиомицитов крысы. Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку. Черные гранулы- сайты локализации К+-транспортирующего белка с м.м. ~ 57 кДа в митохондриях, а также сайты связывания антител с СР.
Такие же гранулы (Рис.21А) обнаружены и в ретикулюме, особенно в месте его слияния с мембраной митохондрий, что подтверждает выявленную нами методом MS-MALDI-TOF/TOF – анализа общность в структуре изучаемого белка с микросомах кальретикулином (м.м. 55 кДа).
Рис.22. Электронная микроскопия эндоплазматический ретикулум (ЭР) на срезе гепатоцитов крысы. Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку.
В контрольных экспериментах, где были использованы только вторичные АТ, гранулы коллоидного золота не были выявлены. Использование антител к канальной субъединице цитоплазматического КАТФ канала – KIR6.2 не обнаружило наличия этого белка-канала в митохондриях (Рис.23, 24).
Рис.23. Электронная микроскопия среза гепатоцита крысы. Контроль (Первичные антитела заменены буфером).
Рис.24. Митохондрии и саркоплазматический ретикулум (СР) на срезе кардиомицитов крысы. б - Контроль (Первичные антитела заменены буфером)
Т.о., полученные результаты показали отсутствие общности в структуре KIR6.2 и изучаемого нами митохондриального белка-канала.
Приведенные в настоящей работе данные позволяют подтвердить, высказанное нами ранее предположение, что белок с м.м. 55 кДа относится к митохондриальной системе АТФ-зависимого транспорта калия и вместе с известными в литературе глибенкламид-связывающими белками митохондрий входит, вероятно, в состав митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, являясь его канальной субъединицей (митоKIR).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая работа посвящена изучению роли митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала (митоКАТФ) в защите сердца от ишемии, формировании адаптации животных к гипоксии, а также исследованию структурной организации данного канала.
В представленной работе также была изучена роль митоКАТФ канала в формировании адаптации животных к кислородному голоданию. Для этого использовали крыс, разделенных на две группы (низкоустойчивые и высокоустойчивые) по способности выдерживать подъем на высоту в 11500 м. Кроме того, в работе низкоустойчивые животные, были адаптированы к недостатку кислорода прерывистой нормобарической гипоксической тренировкой.
Показано, что у высокоустойчивых животных митоКАТФ канал работает эффективнее, а показатели сопряжения дыхательной цепи были выше, чем у низкоустойчивых. Адаптация низкоустойчивых животных к гипоксии сопровождается сопряжением дыхательной цепи и активацией митоКАТФ канала. В то же время, поскольку набухания, которое, как предполагается, должно следовать за активацией митоКАТФ, не наблюдается, так как количество калия в митохондриях, по нашим данным, не увеличивается, а даже снижается, вероятнее всего, активируется также и система выхода калия из митохондрий (система К+/Н+-обменника).